Встраивание мембранных ферментов в липидные везикулы
Страница 1

Мембранная энзимология » Встраивание мембранных ферментов в липидные везикулы

Для встраивания мембранного белка в липидную везикулу прежде всего необходимо избавиться от находящегося в препарате белка детергента, который, если он присутствует в значительных количествах, дестабилизирует фосфолипидный бислой. Обычно детергент удаляют уже из смеси белка с фосфолипидом, но в некоторых случаях белок очищают от детергента до начала реконструкции. Для удаления детергента используют гель-фильтрацию, диализ или адсорбцию на поверхности шариков из полистирола. Последний способ применяют в первую очередь для удаления тритона Х-100. Все перечисленные методы довольно эффективны, однако следует иметь в виду, что даже после самых интенсивных обработок в системе обычно всегда остается то или иное количество связанного детергента.

Методы реконструкции можно разделить на две группы.

I. Процедуры, при которых белок предварительно очищают от детергента, а затем проводят реконструкцию.

II. Процедуры, в которых белки и фосфолипиды смешивают в присутствии детергента, а затем удаляют детергент до образования протеолипосом. Единственное ограничение здесь состоит в следующем: выбранный фосфолипид должен быть способен к формированию стабильных бислоев. Нельзя, например, использовать ненасыщенные фосфатидилэтаноламины. Весьма удобен суммарный фосфолипид из соевых бобов, поскольку он относительно недорог, легкодоступен и применим во многих случаях.

I. Реконструкция без избытка детергента

Условия включения мембранных белков в предварительно сформированные фосфолипидные везикулы часто совпадают с условиями, способствующими слиянию фосфолипидных везикул. В основе обоих процессов лежат определенные нарушения бислойной структуры, или образование "дефектов", которые могли бы облегчить как встраивание белка, так и слияние везикул. Механизмы этих процессов изучены мало. Возможной трудностью в применении этих методов является агрегация белка.

1. Инкубация белка с заранее полученными везикулами. Этот способ применим далеко не всегда и используется для реконструкции не пронизывающих бислой белков с ограниченной гидрофобной поверхностью, например цитохрома bs и /З-гидроксибутиратдегидрогеназы. Конформация встроенного таким образом белка, однако, отличается от нативной.

Реконструкция с участием амфифильных катализаторов. В ряде работ было показано, что добавление в белково-фосфолипидную смесь амфифильных веществ в низких концентрациях облегчает встраивание в везикулы таких мембранных ферментов, как бактериородопсин или цитохром с-оксидаза. В качестве амфифильных веществ использовали холестерол, короткоцепочечные фосфатидилхолины и жирные кислоты. Данный способ хорош тем, что в нем не используются какие-либо грубые процедуры, в том числе обработка избытком детергентов, однако пока он мало распространен.

Замораживание-оттаивание/обработка ультразвуком. В некоторых случаях с успехом используется метод замораживания-оттаивания смеси с последующей обработкой ультразвуком. Эта методика, однако, применяется нечасто из-за опасности денатурации белка. Иногда для облегчения реконструкции используют простую обработку ультразвуком. Вероятнее всего, белок вначале включается в маленькие везикулы, обладающие высокой кривизной. Замораживание-оттаивание, возможно, нужно для слияния мелких протеолипосом в более крупные и более однородные по размерам.

2. Реконструкция с использованием детергентов

В настоящее время для реконструкции гораздо чаще используют методики, состоящие в солюбилизации смеси белка и фосфолипида детергентом и последующем удалении детергента. После его удаления белок и фосфолипид спонтанно формируют однослойные везикулы, вполне пригодные для энзимологических исследований. Обычно выбирают детергенты с высокой критической концентрацией мицеллообразования и малыми размерами мицелл, с тем чтобы их можно было легко удалить диализом или гельфильтрацией. Чаще всего используют холат натрия и октилглюкозид. Распределение полученных везикул по размерам определяется соотношением детергент: фосфолипид, а также способом и скоростью удаления детергента. Обычно используют диализ как более медленный способ. В качестве примеров можно привести встраивание цитохром с-оксидазы и Na + /K+-ATPa3bi.

С помощью такой методики можно ввести в везикулы отличные от фосфолипидов вещества, например холестерол или убихинон. В ряде случаев возникает необходимость в достаточно быстром удалении детергента, особенно если белок нестабилен при его избытке. Тогда применяют гельфильтрационную хроматографию, тоже позволяющую эффективно отделить белково-липидные везикулы от детергента. На рис.1 показан профиль элюции с такой колонки.

Страницы: 1 2


Интересное на сайте:

Сравнительный анализ одного помещения в разные периоды времени
На втором этапе исследований был проведен сравнительный анализ загрязненеия воздуха в одном и том же помещении, но в разные периоды учебного дня. Объектом для данного исследования был выбран коридор. На таблице 4 и на рисунке 4 представле ...

Клеточный уровень живого
Клеточный уровень организации связан с морфологической организацией клетки, специализацией клеток в ходе развития организма, функциями клеточной мембраны, механизмами и регуляцией деления клеток. Исследования на этом уровне позволяют реш ...

Клетка
Прокариотная клетка обычно покрыта оболочкой (клеточной стенкой), как клетка растений. Но состоит эта упругая, как автомобильная шина, оболочка не из целлюлозы, а из близкого к ней вещества муреина (от лат. «мура» - стенка). Некоторые бак ...