Пируватоксидаза
Страница 1

Мембранная энзимология » Пируватоксидаза

Эта флавиносодержащая дегидрогеназа из Е. coli, катализирующая окисление пирувата до уксусной кислоты и СОг и восстановление убихинона в цитоплазматической мембране, обеспечивает поступление электронов в аэробную дыхательную цепь. Фермент обладает рядом замечательных особенностей. Он растворим в воде и не проявляет никаких характерных для мембранного белка свойств. Однако в присутствии субстрата и кофактора происходит изменение конформации белка, в результате чего формируется центр связывания с мембраной. В этих условиях резко возрастает сродство фермента к детергентам и фосфолипидным везикулам, и белок по своим свойствам становится похож на истинный мембранный фермент. Пируватоксидаза может служить примером фермента, который является цитоплазматическим, пока субстрата мало, но превращается в мембранный, как только концентрация субстрата становится достаточно высокой.

Наибольший интерес при исследовании этого фермента представляла его эффективная активация липидами. Активность фермента можно измерить, используя вместо природного мембраносвязанного акцептора - убихинона какой-либо растворимый в воде искусственный акцептор электронов, например феррицианид. В присутствии липидов каталитическая активность пируватоксидазы возрастает до 50 раз. В отличие от /3-гидроксибутиратдегидрогеназы этот фермент активируется самыми разнообразными фосфолипидами и детергентами. В концентрациях ниже критических концентраций мицеллообразования фермент полностью активируется как анионными, так и катионными детергентами, а исследование связывания детергентов показывает, что в активации участвует очень небольшое число центров связывания. Связывание фермента с фосфатидилхолиновыми везикулами или детергентами не происходит до тех пор, пока не добавлены субстрат и кофактор. В присутствии субстрата и кофактора пируватоксидаза способна связываться и активироваться разнообразными везикулами, полученными из целого ряда фосфолипидов. Связывание происходит в первую очередь за счет гидрофобных, а не электростатических взаимодействий. Связывание липида и активация в случае пируватоксидазы, по-видимому, неразделимы, хотя и не все везикулы связываемого фосфолипида или амфифильного соединения ответственны за активацию фермента. Активация липидами вызывает изменения в спектре поглощения связанного флавина, вероятно, вследствие облегчения реакции переноса электронов.

Конформационные изменения в молекуле пируватоксидазы приводят не только к образованию липидсвязывающего домена, но и к появлению чувствительного к протеазам участка цепи вблизи С-конца. Протеолиз подавляет связывание липидов, но, как это ни удивительно, вызывает активацию фермента в отношении реакции восстановления водорастворимых искусственных акцепторов электронов. Активированный протеазами фермент, однако, уже не может восстанавливать мембраносвязанный убихинон, поскольку утрачивает способность связываться с мембраной.

Как показывают результаты клонирования и секвенирования гена, кодирующего пируватоксидазу, аминокислотная последовательность белка не имеет протяженных гидрофобных участков. Генетические исследования, а также данные по протеолизу показали, что за связывание липида ответствен участок полипептида, локализованный вблизи С-конца. В этом участке имеется короткая потенциально амфифильная а-спираль, которая и может участвовать в связывании с поверхностью бислоя. Получен мутантный штамм Е. coli, у которого пируватоксидаза лишена последних 24 аминокислотных остатков. Такой фермент полностью неактивен in vivo, но in vitro успешно катализирует реакцию с водорастворимым акцептором электронов. Предположительно такой мутантный вариант пируватоксидазы не способен связываться с мембраной даже при высоких концентрациях субстратов, а значит, не может осуществлять катализ, поскольку для этого фермент должен окисляться убихиноном. Приведенное исследование является хорошим примером того, как данные по связыванию липида и активации, полученные in vitro, могут с успехом применяться для объяснения механизма функционирования фермента в клетке.

Страницы: 1 2


Интересное на сайте:

Значение осанки
Значение осанки особенно велико у детей, в период роста и формирования скелета. Неправильные привычные положения тела быстро приводят к деформациям позвоночника, грудной клетки, таза, нижних конечностей, включая стопы. Сколиотическая боле ...

Получение плазмид
Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, то естьсодержащих чужеродный ген, плазмид. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-6 млн. пар нуклеотидов), может с ...

Происхождение и этапы эволюции человека как биологического вида
Решающий вклад в доказательство животного происхождения человека внес Ч. Дарвин («Происхождение человека и половой отбор»(1871), «Выражение эмоций у человека и животных» (1872)). Дарвин проанализировал обширные данные систематики, сравни ...