Пируватоксидаза
Страница 1

Мембранная энзимология » Пируватоксидаза

Эта флавиносодержащая дегидрогеназа из Е. coli, катализирующая окисление пирувата до уксусной кислоты и СОг и восстановление убихинона в цитоплазматической мембране, обеспечивает поступление электронов в аэробную дыхательную цепь. Фермент обладает рядом замечательных особенностей. Он растворим в воде и не проявляет никаких характерных для мембранного белка свойств. Однако в присутствии субстрата и кофактора происходит изменение конформации белка, в результате чего формируется центр связывания с мембраной. В этих условиях резко возрастает сродство фермента к детергентам и фосфолипидным везикулам, и белок по своим свойствам становится похож на истинный мембранный фермент. Пируватоксидаза может служить примером фермента, который является цитоплазматическим, пока субстрата мало, но превращается в мембранный, как только концентрация субстрата становится достаточно высокой.

Наибольший интерес при исследовании этого фермента представляла его эффективная активация липидами. Активность фермента можно измерить, используя вместо природного мембраносвязанного акцептора - убихинона какой-либо растворимый в воде искусственный акцептор электронов, например феррицианид. В присутствии липидов каталитическая активность пируватоксидазы возрастает до 50 раз. В отличие от /3-гидроксибутиратдегидрогеназы этот фермент активируется самыми разнообразными фосфолипидами и детергентами. В концентрациях ниже критических концентраций мицеллообразования фермент полностью активируется как анионными, так и катионными детергентами, а исследование связывания детергентов показывает, что в активации участвует очень небольшое число центров связывания. Связывание фермента с фосфатидилхолиновыми везикулами или детергентами не происходит до тех пор, пока не добавлены субстрат и кофактор. В присутствии субстрата и кофактора пируватоксидаза способна связываться и активироваться разнообразными везикулами, полученными из целого ряда фосфолипидов. Связывание происходит в первую очередь за счет гидрофобных, а не электростатических взаимодействий. Связывание липида и активация в случае пируватоксидазы, по-видимому, неразделимы, хотя и не все везикулы связываемого фосфолипида или амфифильного соединения ответственны за активацию фермента. Активация липидами вызывает изменения в спектре поглощения связанного флавина, вероятно, вследствие облегчения реакции переноса электронов.

Конформационные изменения в молекуле пируватоксидазы приводят не только к образованию липидсвязывающего домена, но и к появлению чувствительного к протеазам участка цепи вблизи С-конца. Протеолиз подавляет связывание липидов, но, как это ни удивительно, вызывает активацию фермента в отношении реакции восстановления водорастворимых искусственных акцепторов электронов. Активированный протеазами фермент, однако, уже не может восстанавливать мембраносвязанный убихинон, поскольку утрачивает способность связываться с мембраной.

Как показывают результаты клонирования и секвенирования гена, кодирующего пируватоксидазу, аминокислотная последовательность белка не имеет протяженных гидрофобных участков. Генетические исследования, а также данные по протеолизу показали, что за связывание липида ответствен участок полипептида, локализованный вблизи С-конца. В этом участке имеется короткая потенциально амфифильная а-спираль, которая и может участвовать в связывании с поверхностью бислоя. Получен мутантный штамм Е. coli, у которого пируватоксидаза лишена последних 24 аминокислотных остатков. Такой фермент полностью неактивен in vivo, но in vitro успешно катализирует реакцию с водорастворимым акцептором электронов. Предположительно такой мутантный вариант пируватоксидазы не способен связываться с мембраной даже при высоких концентрациях субстратов, а значит, не может осуществлять катализ, поскольку для этого фермент должен окисляться убихиноном. Приведенное исследование является хорошим примером того, как данные по связыванию липида и активации, полученные in vitro, могут с успехом применяться для объяснения механизма функционирования фермента в клетке.

Страницы: 1 2


Интересное на сайте:

Распространение и места произрастания
Представители рода распространены в Северном полушарии от Арктики до субтропических горных районов, за исключением можжевельника восточно-африканского (Juniperus procera), распространённого в Африке до 18° южной широты. Большинство видов ...

Биологические загрязнения и болезни человека
Кроме химических загрязнителей, в природной среде встречаются и биологические, вызывающие у человека различные заболевания. Это болезнетворные микроорганизмы, вирусы, гельминты, простейшие. Они могут находиться в атмосфере, воде, почве, в ...

Характеристика основных видов взаимодействия (гравитационное, электромагнитное, сильное и слабое)
1. Гравитационное взаимодействие является универсальным, однако в микромире не учитывается, так как из всех взаимодействий является самым слабым и проявляется только при наличии достаточно больших масс. Его радиус действия не ограничен, ...