Для измерения ионных токов через одиночные каналы первоначально был предложен непрямой метод анализа мембранного шума. Затем был разработан способ прямой регистрации одиночных ионных каналов с помощью метода, который называется пэтч-кламп (patch-clamp). В совокупности эти подходы дали прямые ответы на вопросы, касающиеся функции ионных каналов, как то: какой заряд проходит через одиночный канал? как долго канал остается открытым? как время нахождения ионного канала в открытом или закрытом состоянии зависит от мембранного потенциала?

Пэтч-кламп метод, предложенный Э. Неером, Б. Сакманном и их коллегами, значительно углубил наши знания о функционировании ионных каналов. Для пэтч-кламп регистрации необходимо, чтобы кончик стеклянной пипетки с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки. При удачном подведении, благодаря легкому присасыванию, между клеточной мембраной и стеклом пипетки создается сопротивление больше 109 Ом (отсюда возник термин «гигаомный контакт», gigaohm seal). Когда пипетка соединена с соответствующим усилителем, можно зарегистрировать небольшие токи, проходящие через участок мембраны, находящейся внутри кончика пипетки. Такая конфигурация пэтч-кламп метода называется cell attached (контакт с клеткой). Высокоомный контакт гарантирует, что ионные токи, проводимые этим участком клеточной мембраны, проходят преимущественно через усилительную аппаратуру, а не теряются в месте контакта пэтч-пипетки с клеткой. При использовании пэтч-кламп метода регистрируемые события состоят из прямоугольных токовых сигналов, отражающих процессы открытия и закрытия одиночных ионных каналов. Таким образом, мы в реальном времени можем наблюдать активность одиночных белковых молекул мембраны.

В простом случае токи одиночных каналов появляются нерегулярно и с различной продолжительностью, но с постоянной амплитудой. В некоторых случаях, однако, картина токов может быть более сложной. Некоторые ионные каналы, например, в открытом состоянии могут иметь более чем один уровень проводимости. Кроме того, ионные каналы могут проявлять комплексную кинетику. Например, ток через одиночный ионный канал может выглядеть не как простой прямоугольник, а как «вспышка» открытий канала.

Таким образом, пэтч-кламп метод предоставляет новые уникальные возможности для изучения поведения ионных каналов. Во-первых, изоляция маленького участка мембраны позволяет наблюдать активность всего нескольких ионных каналов, а не тысяч, которые активируются в целой клетке. Во-вторых, высокое сопротивление контакта дает возможность регистрировать даже крайне одиночных ионных каналов и можем провести анализ кинетики каналов.

Пэтч-кламп метод позволяет осуществлять также регистрацию ионных каналов и в других конфигурациях. Достигнув контакта в конфигурации cell attached, можно, отводя электрод, оттянуть участок мембраны для формирования inside-out (внутренняя сторона наружу) конфигурации. В последнем случае цитоплазматическая сторона мембраны будет обрашена к перфузионному раствору. С другой стороны, с помощью небольшого дополнительного присасывания можно прорвать участок мембраны, расположенный внутри регистрирующего электрода, обеспечив контакт последнего с цитоплазмой клетки. В этих условиях будут регистрироваться токи в конфигурации whole-cell (целая клетка). Наконец, после получения конфигурации «целая клетка», можно оттянуть электрод от клетки, сформировав из мембраны сначала тонкую перемычку, а затем, после отделения этого участка, получить конфигурацию outside-out (наружная сторона наружу). Каждая из этих конфигураций имеет свои преимущества, их использование зависит от типа изучаемого ионного канала и той информации, которую мы хотим получить в данном эксперименте. Например, для аппликации веществ на внешнюю сторону мембраны предпочтительной является конфигурация outside-out.

Интересное на сайте:

Пирамиды чисел, биомасс, энергии
Понятие о трофических уровнях. Трофический уровень - это совокупность организмов, занимающих определенное положение в общей цепи питания. К одному трофическому уровню принадлежат организмы, получающие свою энергию от Солнца через одинако ...

Космологический Горизонт и крупномасштабная (ячеистая) структура Вселенной
Итак, два важнейших наблюдательных факта, лежащих в фундаменте современной космологии, мы уже отметили - фридмано-хаббловское расширение Вселенной и гамовское реликтовое излучение. Их сопоставление ведет к логическому выводу о существован ...

Хромосомная теория наследственности Г. Н. Менделя (1863)
Дарвин понимал, что для создания теории эволюции необходимо знание законов наследственности. Ко времени издания "Происхождения видов" Дарвина науке ничего не было известно о наследовании признаков. Согласно взглядам Дарвина на на ...