Для измерения ионных токов через одиночные каналы первоначально был предложен непрямой метод анализа мембранного шума. Затем был разработан способ прямой регистрации одиночных ионных каналов с помощью метода, который называется пэтч-кламп (patch-clamp). В совокупности эти подходы дали прямые ответы на вопросы, касающиеся функции ионных каналов, как то: какой заряд проходит через одиночный канал? как долго канал остается открытым? как время нахождения ионного канала в открытом или закрытом состоянии зависит от мембранного потенциала?

Пэтч-кламп метод, предложенный Э. Неером, Б. Сакманном и их коллегами, значительно углубил наши знания о функционировании ионных каналов. Для пэтч-кламп регистрации необходимо, чтобы кончик стеклянной пипетки с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки. При удачном подведении, благодаря легкому присасыванию, между клеточной мембраной и стеклом пипетки создается сопротивление больше 109 Ом (отсюда возник термин «гигаомный контакт», gigaohm seal). Когда пипетка соединена с соответствующим усилителем, можно зарегистрировать небольшие токи, проходящие через участок мембраны, находящейся внутри кончика пипетки. Такая конфигурация пэтч-кламп метода называется cell attached (контакт с клеткой). Высокоомный контакт гарантирует, что ионные токи, проводимые этим участком клеточной мембраны, проходят преимущественно через усилительную аппаратуру, а не теряются в месте контакта пэтч-пипетки с клеткой. При использовании пэтч-кламп метода регистрируемые события состоят из прямоугольных токовых сигналов, отражающих процессы открытия и закрытия одиночных ионных каналов. Таким образом, мы в реальном времени можем наблюдать активность одиночных белковых молекул мембраны.

В простом случае токи одиночных каналов появляются нерегулярно и с различной продолжительностью, но с постоянной амплитудой. В некоторых случаях, однако, картина токов может быть более сложной. Некоторые ионные каналы, например, в открытом состоянии могут иметь более чем один уровень проводимости. Кроме того, ионные каналы могут проявлять комплексную кинетику. Например, ток через одиночный ионный канал может выглядеть не как простой прямоугольник, а как «вспышка» открытий канала.

Таким образом, пэтч-кламп метод предоставляет новые уникальные возможности для изучения поведения ионных каналов. Во-первых, изоляция маленького участка мембраны позволяет наблюдать активность всего нескольких ионных каналов, а не тысяч, которые активируются в целой клетке. Во-вторых, высокое сопротивление контакта дает возможность регистрировать даже крайне одиночных ионных каналов и можем провести анализ кинетики каналов.

Пэтч-кламп метод позволяет осуществлять также регистрацию ионных каналов и в других конфигурациях. Достигнув контакта в конфигурации cell attached, можно, отводя электрод, оттянуть участок мембраны для формирования inside-out (внутренняя сторона наружу) конфигурации. В последнем случае цитоплазматическая сторона мембраны будет обрашена к перфузионному раствору. С другой стороны, с помощью небольшого дополнительного присасывания можно прорвать участок мембраны, расположенный внутри регистрирующего электрода, обеспечив контакт последнего с цитоплазмой клетки. В этих условиях будут регистрироваться токи в конфигурации whole-cell (целая клетка). Наконец, после получения конфигурации «целая клетка», можно оттянуть электрод от клетки, сформировав из мембраны сначала тонкую перемычку, а затем, после отделения этого участка, получить конфигурацию outside-out (наружная сторона наружу). Каждая из этих конфигураций имеет свои преимущества, их использование зависит от типа изучаемого ионного канала и той информации, которую мы хотим получить в данном эксперименте. Например, для аппликации веществ на внешнюю сторону мембраны предпочтительной является конфигурация outside-out.

Интересное на сайте:

Конструктивный метаболизм
Конструктивный метаболизм направлен на синтез четырех основных типов биополимеров: белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Ниже показана обобщенная условная схема биосинтеза сложных органических соединений, где выделены след ...

Пептидные антибиотики животных как биохимические факторы противоинфекционной защиты
Пептиды, осуществляющие защиту животных от инфекции, широко представлены в природе от простейших до человека. Наиболее распространенным в эволюции типом антимикробных молекул являются катионные цистинсодержащие полипептиды. Наименьшим по ...

Тип саркодовые и жгутиковые
Места обитания, строение и образ жизни. К саркодовым и жгутиковым относятся в основном свободноживущие организмы. Наиболее распространены из них амеба обыкновенная и эвглена зеленая. Амеба обыкновенная живет в придонных местах пресных во ...